Vermehrung rekombinanter Plasmide

Gefunden in einigen Bakterien und Hefe -Arten, sind Plasmide vergleichsweise kleinen , selbst-replizierende DNA-Ringe Hauptchromosom außerhalb einer Zelle befindet . Sie sind sehr nützlich in der Gentechnik , da es relativ einfach ist , um ausgewählte Gene von anderen Spezies in Plasmide spleißen , übertragen zwischen Wirtszellen von der gleichen oder unterschiedlichen Spezies anzuregen und sie zu replizieren - oder Propagation - bei sehr viel höheren als - normal - oder verstärkt - Raten . Rekombinante Plasmide sind einfach diejenigen , die konstruiert wurden , um Gene aus anderen Arten enthalten . Insbesondere mit verstärkten Vermehrung können rekombinante Plasmide schneller und leichter express gewünschten Proteine ​​auf einem großen industriellen Maßstab. Was Sie
Preexisting Plasmid- und Gen- Bibliotheken oder Plasmide und Gene, die Sie sich selbst von ihren Wirtsorganismen isoliert und zusammen
Zellkultur- Anlagen haben gespleißt Brauchen
Amplification (s) Mittel wie Calciumchlorid , Stromschlag , Kälte und Hitze , Chloramphenicol , Stromschlag und /oder Taq -Polymerase-Enzym
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Wählen Sie die Verstärkung Verfahren oder Verfahren, die am besten zu Ihren spezifischen rekombinanten Plasmid -und Host- Organismus . Einige Verfahren arbeiten besser mit bestimmten Plasmiden und Rechner als mit anderen. Wenn Sie mit einem neuen , noch experimentellen rekombinante Plasmid - und /oder versuchen Sie einen anderen Wirtsarten arbeiten , müssen Sie möglicherweise die beste Verstärkungsprozess oder Prozesse durch Versuch und Irrtum zu bestimmen.
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versuchen Sie, den Prozess als Transformation bezeichnet , wenn Ihr bestimmte Plasmid- und Wirtszellartenkönnten darauf reagieren. Kühlen Sie die Zellen und Plasmide auf Null Grad C in einer Calciumchlorid ( CaCl )-Lösung . Erhöhen Sie schnell die Temperatur auf 37-43 ° C. Diese abrupte Temperaturänderung bewirkt, dass die Zellmembranen Größere Mengen der Plasmid zu nehmen .
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senden Hochspannungsimpulsedurch die Lösung von Plasmiden und Zellen Elektroporation wenn das gewünschte Amplifikationsverfahren . Diese Technik erhöht die Permeabilität der Zellmembran zu den Plasmiden .
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Expose der Wirtszellkultur auf ein niedriges Niveau des Antibiotikums Chloramphenicol , so viele wie hundert Plasmide pro Zelle zu erzeugen. Dieses Verfahren unterdrückt die Replikation des Haupt Chromosomen der Wirtszellen ", während Induktion unkontrollierte Replikation des Plasmids , einschließlich des Gens hinein gespleißt.
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Anwenden der Polymerase- Kettenreaktion oder PCR-Verfahren , um Plasmid- Kopien zu sehr zu erzeugen Hochgrößenordnungen . PCR auf DNA- Polymerisation , die chemische Reaktion , durch die genetischen Sequenzen bilden in der Natur. PCR wird meist durch ein hitzestabiles Enzym namens der Taq-Polymerase , aus einer Bakterienspezies , die in heißen Quellen lebt extrahiert katalysiert.