Wie Verdünnungen Antikörper für IHC- Marke

Immunhistochemie ( IHC) ist eine Technik, die von Fachwissenschaftlernverwendet, um Zellen in Geweben , die auf einem Objektträger gebracht und mit einem geeigneten Antikörper, der ein Protein, das einzigartig in der Zell-oder Gewebe ist unter erkennt gefärbt wurden visualisieren Untersuchung . Antikörper- Verdünnungen ( Titrationen ) , müssen unter Verwendung der in eigenen Protokoll des Benutzers angegeben Versuchsbedingungen , nicht, dass der Hersteller des Antikörpers , da die beiden nicht identisch sein. Was Sie
Zellen brauchen , um Flecken
Antikörper
Verdünnungspuffer ( " Verdünnungsmittel " )
Pipetten und Spitzen
Mikrozentrifugenröhrchen
Aluminiumfolie
Lab Marker und Etiketten Rohr
Ice
lichtgeschützt Gleitkasten
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prüfen und vorzubereiten , die den Antikörper . Stellen Sie sicher, dass der Antikörper in der richtigen Host angehoben worden , und reagiert mit der genauen Version des Proteins (wie der Isoform oder Splice-Variante bekannt) , die getestet wird . Mit einer Pipette vorsichtig einen 10 Mikroliter Teil davon und Etikett als " persönlichen Vorrat .

Wenn nur sehr kleine Mengen von Antikörper verfügbar sind, diesen Schritt überspringen.

Aufrechterhaltung einer persönlichen Vorrat von Antikörper ist Routine in allen Laboratorien , wie es Kreuzkontamination des ursprünglichen Bestandes verhindert. Dispense diese in eine lichtgeschützte Mikrozentrifugenröhrchen oder einem normalen Mikrozentrifugenröhrchen , die in Aluminiumfolie eingewickelt wird , um vor Licht zu schützen.

Halten Sie dieses Röhrchen auf Eis , vorzugsweise in einer Esky mit einem luftdichten Deckel , wieder ans Licht zu minimieren, die die Antikörper zerstören können. Notieren Sie sich die Original- Aktie Konzentration (zB 100 Einheiten pro Milliliter , 1 Milligramm pro Mikroliter und so weiter ) auf dem Schlauch, einschließlich des Namens des Antikörpers und was , wenn überhaupt , Puffer wird in (z. B. Serum, Kochsalzlösung verdünnt , oder Wasser usw.).
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vorbereiten Verdünnungspuffer , der auch als Antikörper- Verdünnungsmittel bekannt. Überprüfen Sie, ob dies mit dem Antikörper und dem immunhistochemischen Verfahren verwendet kompatibel ist, zum Beispiel , sollte es keine Fluoreszenz zu verschleiern oder zu hemmen, eine nachträgliche Sekundärantikörpermarkierung. Machen Sie eine Standard- Immunhistochemie Verdünnung ( auch die Blocking-Puffer ) durch Mischen 1X Phosphat- gepufferte Kochsalzlösung mit 1% Triton -X100 , 10 % fetales Kälberserum und 0,2 % Natriumazid.
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titriert die Antikörper . Mit der gegebenen Konzentration des Antikörpers in der persönlichen Vorrat (wie Konzentration Einheiten wie Mikrogramm pro Mikroliter ausgedrückt ) , bestimmen das Volumen von Antikörper benötigt, um 10 Mikrogramm Antikörper zu erhalten .

Eine Verdünnungsreihe durch Pipettieren ein Volumen Set entsprechend 2 Mikrogramm Antikörper ( z. B. X ul ) in 100 ul Verdünnungsmittel und gründlich durch auf-und Abpipettieren . Von diesem Ausgangsverdünnung , nehmen Sie die gleichen X Mikroliter und hinzufügen, dass zu einem späteren 100 Mikroliter Verdünnungsmittel. Wiederholen Sie dies, bis 10.08 Verdünnungen ( oder einer Serie) gesetzt hat.

Das letzte Rohr wird deshalb haben die niedrigste Konzentration und die " Sättigungs " Konzentration, die die höchste Signal während des Experiments generieren. Allerdings wird die ideale Konzentration geringfügig stärker konzentriert als diese, so dass nicht zu viel Signal erzeugt wird, welche Hintergrundfehlerverursachen können.

Die Rohre richtig mit den neuen Konzentrationen verdünnt Beschriften .