Zelloberflächen -Biotinylierung Protokoll

Biotinylierung verwendet die Fähigkeit des lösliche Vitamin Biotin an die Zellproteine ​​. Biotin bindet an das Protein Streptavidin und ist daher nützlich in der Zellbiologie , Zellproteine​​zu visualisieren. Biotinylierung ermöglicht das sichere Markierung von Proteinen im Vergleich zu Techniken, wie Radioaktivität und hat keinen Einfluss auf die normale Funktion der Zelle. Es erlaubt Forschern, Zellproteine ​​wie Rezeptoren zu untersuchen , und das ermöglicht ein besseres Verständnis von Erkrankungen und Krankheitsprozessen . Labeling suspendierten Zellen

Waschen der Zellen in eiskaltem phosphatgepufferter Salzlösung ( PBS) , um Verunreinigungen zu entfernen. Puffer Tris und Glycin enthalten, werden mit Biotinylierung konkurrieren und sollten vermieden werden. Biotinylierung von Proteinen zur internen vermeiden, kann die Markierung bei 4 ° C oder in Gegenwart von Azid durchgeführt werden. Die Zellen in PBS und der löslichen Biotin, Sulfo-NHS -LC - Biotin.
Labeling adhärenten Zellen

Waschen der Zellen in PBS und Inkubation mit einem Produkt wie Sulfo -NHS -LC - Biotin. Die Zellen werden dann in eine Schale gekratzt und in einem Puffer, der das Detergens Triton X - 100 lysiert und für die Visualisierung erstellt.
Vorbereitung Zellen markiert

Nach Inkubation werden die Zellen zu einem Pellet zentrifugiert und in PBS gewaschen. Die Zellen werden in PBS resuspendiert und mit der IgG- Sepharose- Gel gereinigt. Das gebundene Protein wird in Ladepuffer und auf 100 Grad Celsius verdünnt.
Visualisierung Cells

verwässerte Proteine ​​mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gel-Elektrophorese sichtbar gemacht werden (SDS- PAGE) durch Blotting mit dem Protein und Enzym-Mix , Streptavidin - Meerrettichperoxidase gefolgt . Blots werden mit einer chemischen Reaktion --- Chemilumineszenz --- das Licht emittiert visualisiert. Die Spezifität der Biotinylierung kann mit Antikörpern für das Protein unter-Studie bestätigt werden.