Wie messen NADH

NAD und NADH sind beide Pyridinnucleotide im Stoffwechsel beteiligt. NADH und NAD sind Co-Enzyme in den Mitochondrien gefunden wird, die Kraftwerke der Zelle . Sowohl NAD und NADH werden in zellulären Reaktionen wie Atmung und Photosynthese , wo Energie und Wasserstoff erzeugt werden, beteiligt. NAD und NADH Kraftstoff biochemischen Reaktionen, die eine Reihe von Enzymen, ATP, dem Hauptenergiequelle in Zellen erfordern . Was Sie
Zellen oder Gewebe zu unter Brauchen
NADH -Assay-Kit
Phosphat - gepufferte Kochsalzlösung
Trockeneis
Heizung Block
96 -Well-Platte
Centrifuge
beschriftet Rohre
Plattenlese
Vortex
Bekannte Konzentration von NADH
Weitere Anweisungen
Assay
1

waschen Sie die Zellen oder Gewebe unter -Studie mit kaltem Phosphat anzeigen Kochsalzlösung , PBS . Auszug Zellen oder Gewebe brechen in Extraktionspuffer , indem Sie die Mischung auf Trockeneis für 20 Minuten und dann bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Wiederholen .
2

Vortex für 10 Sekunden. Spin in einer Zentrifuge für 5 Minuten , um Zell-oder Gewebetrümmer zu pelletieren . Überstand entfernen , die flüssige Phase , und legen Sie die Flüssigkeit in ein sauberes Röhrchen .
3

Filter Stand durch einen Filter, um spezielle Enzyme, die Aufteilung NADH .
4 wird entfernen

entfernen 200 Mikroliter , in ein sauberes Röhrchen und Wärme bei 60 Grad Celsius im Thermoblock für 30 Minuten zu NAD zu denaturieren. Kühl und Zentrifuge und entfernen flüssigen Phase. Überweisung 50 Mikroliter in eine 96 -Well-Platte ; jede Probe sollte in doppelter oder dreifacher Ausfertigung . Um festzustellen, insgesamt NAD , NADT , nicht erwärmen .
5

vorbereiten und fügen Radsport -Mix in die 96- Well-Platte. Mischen und Inkubation für 5 Minuten. In 10 Mikroliter der Entwickler und verlassen, um bei Raumtemperatur für bis zu 4 Stunden inkubiert. Stopplösung . Lesen Farbänderung auf einem Plattenlesegerät oder Fluorimeter je nach Kit .
Standardkurven-und Berechnungs
6

Bereiten Sie eine Standardkurve , indem eine bekannte Konzentration von NADH und Verdünnen in Extraktionspuffer . In verschiedenen Konzentrationen verdünnt , wodurch das Ende Volumen bleibt die gleiche wie Prüflinge . Platte auf der gleichen 96 -Well-Platte als Testproben . Lesen optischer Dichte.
7

Zeichnen Standardkurve Graph mit Konzentration auf der X-Achse und die optische Dichte auf der Y-Achse. Nehmen Sie einen Durchschnitt von jeder Testprobe und lesen Sie die Konzentration aus der Standardkurve Graphen.
8

Berechnen Sie die NAD /NADH -Verhältnis durch Subtraktion Gesamt NAD , NADT von NADH und dann dividiert durch NADH .