So wählen Sie Restriktionsenzyme

Restriktionsenzyme sind Enzyme die sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige DNA schneiden. Jedes Restriktionsenzym hat eine spezifische Nukleotidsequenz die als Restriktionsstelle bezeichnet wird und die es erkennt und schneidet. Restriktionsenzyme werden zur DNA-Sequenzierung Mutationsanalyse sowie zur Klonierung und Amplifikation von DNA verwendet. Wissenschaftler verwenden Restriktionsenzyme um Gene von Interesse in Expressionsvektoren einzufügen DNA-Moleküle die sich getrennt von chromosomaler DNA replizieren können. Der Vektor der das Gen von Interesse enthält kann dann in einen Bakterienstamm zur Expression und Charakterisierung von Proteinen eingeführt werden.

Identifizieren Sie Restriktionsenzymstellen auf Ihrem Vektor indem Sie sich eine Restriktionskarte ansehen. Die Restriktionskarte zeigt Ihnen welche Enzyme Ihren Vektor schneiden und wo.

Wählen Sie ein Restriktionsenzym das auch eine Stelle auf Ihrer Geninsertion aufweist indem Sie die Sequenz der einfügen. Stellen Sie sicher dass sich die Restriktionsstelle auf Ihrer Insertion außerhalb des interessierenden Gens befindet damit Sie keinen Teil des Gens verlieren.

Stellen Sie sicher dass keine Duplikate des Gens vorhanden sind Restriktionsstelle irgendwo in Ihrem Gen-Insert oder Vektor. Dies führt zu mehreren Schnitten in Ihrer DNA und führt zu irreführenden Daten.

Versuchen Sie Restriktionsenzyme zu wählen die nicht mit stumpfen sondern mit klebrigen Enden schneiden. Sticky Ends treten auf wenn das Enzym doppelsträngige DNA gestaffelt schneidet wobei ein einzelsträngiger Überhang verbleibt der die Befestigung mit einem Insert erleichtert das auf die entgegengesetzte Weise geschnitten wurde. Stumpfe Enden treten auf wenn die doppelsträngige DNA glatt geschnitten wird und diese schwieriger zu befestigen sind.

Wählen Sie für beide Enden Ihres Inserts ein anderes Restriktionsenzym um dies sicherzustellen wird in der richtigen Ausrichtung in den Vektor eingefügt um sicherzustellen dass sich der Vektor nicht erneut an sich selbst bindet. Versuchen Sie zwei Restriktionsenzyme auszuwählen die im gleichen Puffersystem und bei der gleichen Temperatur gut funktionieren . Wenn dies nicht möglich ist führen Sie jeden Aufschluss separat durch.

Tipp

Einige Webprogramme wurden entwickelt um Restriktionsstellen auf einer DNA-Sequenz schnell zu identifizieren. Ein solches Programm stammt von New England BioLabs.

Erforderliche Dinge

Sequenz der Geneinfügung

Restriktionskarte für einen Vektor der Wahl

> Liste der Restriktionsenzyme und ihrer Schnittstellen