QuikChange Mutagenese Protokolle

QuikChange Mutagenese ist der Markenname eines Kits in der biotechnologischen Forschung verwendet werden, um genetische Mutation oder DNA- Veränderung herbeizuführen. Agilent Technologies ist das Unternehmen hinter dem Produkt, das in zwei Versionen erhältlich , QuikChange II und QuikChange Lightning ist . Beide Kits enthalten eine Pufferlösung , die das Enzym DNA-Polymerase , Farbreagenzien , DNA-Sequenzen oder Primer und Zellproben . Mutant Strand Synthese -Protokoll für

Techniker synthetisieren zwei Oligonukleotide oder kurze DNA- Sequenzen , die die gewünschte Mutation. Dann bereiten sie die Steuerung der Reaktion mit der DNA-Sequenzen , dNTP-Mix -Lösung und DNA -Polymerase-Enzym , mit destilliertem Wasser. Später bereiten sie eine Reihe von Probenreaktionen unter Verwendung verschiedener Konzentrationen von doppelsträngiger DNA (dsDNA ) , während Primer oder Oligonukleotide Konzentration konstant , nach den Anweisungen des Herstellers . Sie halten die Proben bei 203 Grad F für 30 Sekunden. Die Probe, die DNA-Segment Nummer zwei ist auch unter Temperaturzyklen getestet , eine Technik, bei Temperaturänderungen während kurzer Zeit. Schließlich werden die Proben auf Eis für zwei Minuten gegeben .
DpnI Verdauung der Produkte Amplification Protocol

DpnI Restriktionsenzym schneidet die DNA an bestimmten Stellen . Ein Mikro- Liter dieses Enzym direkt zu jedem Verstärkungsreaktion unter seinem Standard- Mineralölschicht mit einer Mikropipette oder spezialisierte Aerosol -resistente Pipettenspitze aufgenommen. Jedoch wird eine Mineralölschicht nur erforderlich, wenn der Thermocycler eine Vorrichtung verwendet, um DNA-Segmente zu amplifizieren , nicht über eine Heißplattenanordnung. Die Reaktion wird sanft gemischt und dann in einer Mikrozentrifugefür eine Minute gesetzt . Danach werden die Proben bei 98,6 Grad Celsius für eine Stunde inkubiert .
Transformation von XL1-Blue superkompetente Zellen Protokoll

XL1-Blue ist ein Tetracyclin - resistenten Zelllinie , die mit den QuikChange Mutagenese -Kits kommt . Während dieses Protokolls wird auftauen Techniker die Zellen , die zuvor bei -112 º F gehalten wurden , auf Eis. Dann haben sie ein Mikroliter der DpnI - behandelten DNA hinzufügen , erhitzen Sie es auf 107,6 Grad F für 45 Sekunden und legen Sie die Reaktion auf Eis für zwei Minuten. Nach dieser Prozedur hinzufügen Techniker eine Zubereitung von NZY (Casein -Hydrolysat und Hefeextrakt ) vorgewärmt auf 107,6 Grad F und Inkubation für eine Stunde. Das Präparat wird dann auf Agar- Gel -Platten gegeben und bei 98,6 Grad F für 16 Stunden inkubiert.