Warum mussten Sie die Brunnen nach jedem Schritt waschen?

Das Waschen der Mikroplattenvertiefungen nach jedem Schritt in verschiedenen biochemischen und molekularbiologischen Tests wie ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), DNA/RNA-Isolierung, PCR und Western Blotting ist ein wesentlicher Bestandteil des Versuchsprotokolls. Der Zweck der Waschschritte besteht darin, restliche Reagenzien, Reaktionskomponenten oder etwaige Verunreinigungen zu entfernen, die nachfolgende Schritte beeinträchtigen oder die Genauigkeit und Spezifität des Tests beeinträchtigen könnten.

Hier sind einige Gründe, warum Waschschritte notwendig sind:

Entfernung ungebundener Stoffe: Waschschritte nach der Zugabe von Reagenzien oder Antikörpern helfen, alle ungebundenen Substanzen zu entfernen, wie z. B. überschüssige Antikörper, unspezifische Bindungsmoleküle oder Reaktionskomponenten, die nicht eingefangen oder an die Festphase gebunden werden. Dadurch wird sichergestellt, dass das Erkennungssignal spezifisch und frei von Hintergrundstörungen ist.

Kreuzkontamination minimieren: Waschschritte verringern wirksam das Risiko einer Kreuzkontamination zwischen Proben. Dies ist besonders wichtig, wenn mehrere Proben gleichzeitig verarbeitet werden, da so die Übertragung von Reaktionskomponenten oder Verunreinigungen von einer Vertiefung zur anderen verhindert wird. Durch das Waschen bleibt die Integrität und Genauigkeit der einzelnen Probenergebnisse erhalten.

Effiziente Entfernung störender Substanzen: Das Waschen ist notwendig, um Substanzen zu entfernen, die nachfolgende Schritte beeinträchtigen könnten. Beispielsweise trägt das Waschen in einem ELISA-Assay dazu bei, ungebundene Konjugat-Antikörper-Komplexe zu entfernen, wodurch die Hintergrundfarbentwicklung verringert und die Spezifität der kolorimetrischen Reaktion erhöht wird. Bei der PCR werden durch das Waschen Nukleotide, Primer und Polymerasen aus vorherigen Amplifikationszyklen entfernt, wodurch das Risiko einer Verschleppungskontamination minimiert und eine genaue Amplifikation im nächsten Zyklus sichergestellt wird.

Standardisierung und Reproduzierbarkeit: Durch die Befolgung standardisierter Waschverfahren stellen Forscher sicher, dass die Bedingungen in allen Experimenten und zwischen verschiedenen Labors konsistent sind. Diese Konsistenz ist entscheidend für die Erzielung zuverlässiger und reproduzierbarer Ergebnisse.

Der Waschvorgang kann die Verwendung einer Mehrkanalpipette oder eines automatischen Plattenwaschgeräts zum Dosieren und Absaugen des Waschpuffers umfassen. Der Waschpuffer ist typischerweise eine gepufferte Salzlösung, die der Zusammensetzung des im Test verwendeten Originalpuffers ähnelt, aber keine Reaktionskomponenten enthält.

Ausreichendes Waschen ohne übermäßiges Waschen ist entscheidend. Übermäßiges Waschen kann zum Verlust wesentlicher, an die feste Phase gebundener Komponenten führen und die Empfindlichkeit des Tests beeinträchtigen. Daher werden Waschprotokolle sorgfältig entwickelt, um eine optimale Entfernung unerwünschter Substanzen zu erreichen und gleichzeitig die Integrität der immobilisierten Moleküle oder Analyten von Interesse zu bewahren.