Wie NADH Detect

Nicotinamid -Adenin- dinuceltoide (NADH ) , abgekürzt " NAD " , ist ein Coenzym in lebenden Zellen gefunden , die chemische Reaktionen in Proteinen produziert . Pharmazeutische Unternehmen studieren NADH wegen seiner Stoffwechselprozess und synthetisch schaffen es für eine Reihe von Zwecken . Da NADH ist mikroskopisch, kann mit dem bloßen Auge nicht zu erkennen ist . Sie müssen wissenschaftliche Tests und ein Assay -Kit , um seine Präsenz zu erkennen. Was Sie brauchen
Trockeneis
Micro - Zentrifuge
Eppendorf-Röhrchen
Weitere Anweisungen
Reagenzrekonstitution
1

Stellen Sie die Fahrrad Puffer anzeigen ein Zähler und damit der Puffer auf Raumtemperatur zu erreichen. Die ideale Temperatur für den Puffer beträgt 22 Grad Celsius.
2

Rekonstitution der NAD Radfahren Enzym-Mix mit genau 220 Mikroliter der Radsport -Puffer. Frieren Sie die Lösung bei Temperaturen unter -70 Grad Celsius.
3

Rekonstitution der NADH -Entwickler mit 1,2 ml ddH2O . Vorsichtig mischen der Lösung, bis es vollständig gelöst ist. Nicht Wirbel.
4

rekonstituieren NADH -Standard mit 200 Mikroliter reinen Dimethylsulfoxid .
Probenvorbereitung
5

Waschen Sie die Zellen mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung.
6

Pellet 2x10 (5 )-Zellen für jeden einzelnen Test in einen Mikrozentrifugenröhrchenund bei 2.000 rpm für 5 Minuten.
7

Extrahieren Sie die Zellen mit 400 Mikroliter der NAD /NADH Extraktionspuffer durch Einfrieren und Auftauen der Zellen in zwei Zyklen - 20 Minuten auf Trockeneis und 10 Minuten bei Raumtemperatur. Vortex die für genau 10 Sekunden extrahierten Zellen .
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die Zellproben in einem Mikrozentrifuge bei 14.000 RPM für genau 5 Minuten Spin .
9

Übertragen Sie die NAD /NADH Zellen in ein sauberes Röhrchen .
Assay-Protokoll
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verdünnen 10 Mikroliter der NADH -Standard mit 990 Mikroliter NAD /NADH Extraktionspuffer . In 0, 2, 4, 6 , 8, 10 Mikroliter der verdünnten Lösung in eine 96 -Well-Platte in zweifacher Ausfertigung zu erstellen, 0 , 20, 40, 60 80, 100 und Standard. Füllen Sie den letzten gut mit 50 Mikroliter der NAD /NADH Extraktionspuffer .
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Überweisung 50 Mikroliter der Zellproben extrahiert in eine 96 -Well-Platte in Doppel wie zuvor.
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die Zellproben für die NADH- Detektion vorbereiten . Zerlegen der NAD aus den Zellproben , indem 200 Mikroliter der Zellproben entnommen , in Eppendorf-Röhrchen . Erhitzen der Rohre bis 60 Grad Celsius genau 30 in einem temperaturgeregelten Wasserbad Minuten. Kühlen die Proben schnell , indem sie die Röhrchen auf Eis . Drehen Sie die Proben in der Mikrozentrifuge, um Niederschläge zu entfernen. Überweisung 50 Mikroliter der Proben zerlegt in eine 96 -Well-Platte in Doppel wie zuvor.
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Mischen Sie die NAD Radfahren Puffer -Mix mit 100 Mikroliter NAD Radfahren Puffer -Mix und zwei Mikroliter des NAD Radfahren Enzyms. In 100 Mikroliter der neuen Lösung in jede Vertiefung der NADH- Standards und Proben .
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Die Platte bei Raumtemperatur für genau 5 Minuten. Dieser Prozess wird die NAD zu NADH konvertieren.
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10 Mikroliter der NADH -Entwickler in jedem gut hinzufügen. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für mindestens 1 Stunde und maximal 4 Stunden lang sitzen .
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Sie die Platte und die Berechnung der NADH .