, Wie ein ELISA-Test durchführen

ein ELISA oder enzymgebundenen Immunassayist ein biochemischer Laborverfahrendurchgeführt, um ein Antigen (wie ein Protein) oder Antikörper in einer Versuchsprobe nachzuweisen . Der Assay nutzt die Antikörper-Antigen- Bindung und kann verwendet werden, um zu testen , sowie andere Zellen und molekularen Bindungsmechanismen werden. In einem Protein -basierten ELISA-Assay , einen " einzufangen " Antikörper oder Protein wird in einem Assay- Schale gelegt und man ließ es an der Schale haften , wonach die "Sonde" Mittel (wie ein Protein von Interesse ist ) ist festgelegt und mit dem Fänger inkubiert. Nach mehreren Waschanlagen, eine " Erkennung" Antikörper , um die Gegenwart oder Abwesenheit von Antikörper-Antigen- oder Protein -Protein-Bindung zu visualisieren aufgenommen. Was Sie
Assay Gericht (zum Beispiel 96-Well- Block) Brauchen
Capture- Antikörper ( 5 ug /ml verdünnt in 50 mM NaHCO2 , pH 9,6)
Probe Antikörper /Protein ( verschiedene verdünnt Konzentrationen )
Nachweisantikörper (z. B. Meerrettich- Peroxidase-gekoppelten Antikörpers )
PT -Puffer ( 1 × PBS , 0,05 Prozent Tween-20 )
Blockierungspuffer ( 1 × PBS mit 5 mg /ml BSA , oder 5 Prozent Magermilch in 1x PBS)
Erkennung Reagenz (dh TMB Reagenz-Mischung )
Mechanische Laborschüttler
Kühlraum oder Kühlschrank
Pipetten und Tipps
Weitere Anweisungen
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bis 5 ug /ml in 50 mM NaHCO2 (pH 9,6) verdünnt Capture-Antikörper . Dann werden 50 ul zu jeder Vertiefung der Probenschale für den Test verwendet . Deckel mit Kunststoff oder Aluminium und Inkubation über Nacht bei 4 ° C auf einem Schüttler .
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Dump aus Capture-Antikörper und waschen zweimal mit 200 ul PT -Puffer. Geben Sie 200 ul Blockierungspuffer pro Well (PB oder 5 Prozent Magermilch ) . Inkubieren überall von zwei Stunden, um über Nacht unter Schütteln bei 4 ° C
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Dump aus Blockierungspuffer und Wasch 4-mal mit 200 ul PT -Puffer. In "Sonde" Proteinproben in verschiedenen Konzentrationen in PB oder 5 Prozent Magermilch, Zugabe von 100 ul pro Well . Inkubation 1 Stunde Schütteln bei 4 ° C Dump aus Sonde Lösungen und waschen sechsmal mit 200 ul PT -Puffer.
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hinzufügen Detektions-Antikörper (HRP -konjugierte Antikörper), verdünnt 1:4000 in PB Puffer oder 5 Prozent Magermilch (entweder ein , die 0,05 Prozent Tween -20) , Zugabe von 50 ul pro Probe auch. Inkubation für 30 Minuten bis eine Stunde bei 4 ° C unter Schütteln
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Dump aus-Detektionsantikörperlösungund waschen Sie 6 -mal mit 200 ul PT -Puffer pro Vertiefung , gefolgt von zweimaligem Waschen mit 200 ul 1x PBS (Phosphat - gepufferte Salzlösung) . Dump aus PBS und 100 ul Nachweisreagenz pro Well ( für HRP , verwenden Sie frisch gemischten TMB -Reagenz durch Mischen von TMB und Wasserstoffperoxid bei 1:1). Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Schütteln .
< P > bei der Verwendung von TMB und HRP : Schließlich, fügen Sie 100 ul 1 M H3PO4 ( Phosphorsäure) pro Vertiefung , um die Reaktion zu stoppen TBM

lesen Platte mit Probenanalyse Leser , wie eine 96-Well- Plattenlesegerät . . ( Für HRP und TMB , benutzen Sie die " ELISA- End -Point- Assay" -Vorlage auf die meisten Leser . )