Wie man einen FRET Assay durchzuführen

Fluoreszenz -Resonanz-Energie -Transfer (FRET ) ist eine Testtechnik verwendet, um das Vorhandensein und die Menge der Bindung zwischen zwei Reporter -verknüpften Proteinen zu messen. Dieser Assay wird üblicherweise verwendet, um potentiell bindenden Proteinen in verschiedenen Zelltypen zu analysieren und die Wirksamkeit der Konjugation Typ-Enzyme zu messen. Die Detektoren benötigt wird, hängt weitgehend von der Art der Reportermoleküle verwendet werden, obwohl oft kann ein einfaches 96-Well Plattenlesegerät verwendet werden. Was Sie benötigen
Protein-of-interest/Reporter Molekül konstruiert für jedes Protein ist
96 -Well-Platte Block
96-Well- Plattenlesegerät
Reaktionspuffer getestet (in der Regel Tris- oder Phosphat gepufferte Kochsalzlösung -basiert)
Konjugation Enzym (falls erforderlich)
anzeigen Weitere Anweisungen
Setup- und Lese
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generieren oder bereiten Fusionskonstrukte jedes Protein von Interesse , wobei jede mit einem Fluoreszenz - Molekül Übertragungs wie grün fluoreszierendes Protein (GFP) , Rhodamin oder Bor - Dipyrromethen ( BODIPY ) verbunden .
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Bestimmen Absorption -und Emissionswellenlängen von jeder Leuchtstoffkomponente und der Gesamttest . ( Zum Beispiel, wenn der Assay misst GFP -> Rhodamin -Fluoreszenz -Energietransfer ist die Eingangsabsorptionswellenlängeder von GFP der Extinktion ( 488 nm ) und die Emissionswellenlängeist, dass Detektions Rhodamin ( 595 nm) )
.
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erstellen Sie entsprechende Reaktionspuffer für das Experiment , abhängig von den Proteinen der biochemischen Eigenschaften Interesse . Ein TRIS -basierten Puffer wird oft verwendet , einschließlich Calciumchlorid und 0,05 Prozent Tween-20 . Spezifische Konzentrationen und Komponenten können durch die Suche nach Journaleinträge Detaillierung ähnliche Reaktionen und Bedingungen bestimmt werden.
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Mischen Sie die zwei Reporter -konjugierte Proteine ​​von Interesse in verschiedenen Konzentrationen in der Reaktionspuffer und aliquoten 50-200 ul pro Well . Fügen Sie eine Konjugation Enzym (zum Beispiel Sortase ) zu jeder Probe und gegebenenfalls . Wenn die Durchführung einer Endpunktassayermöglicht die Inkubation bei Raumtemperatur ( oder Enzyms optimale Temperatur ) für einen bestimmten Zeitraum , dann auf 96 -Well-Platte -Lesegerät gelesen . Bei Durchführung einer Kinetik -Assay , gehen Sie direkt zu lesen ( siehe unten).
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einfügen Probenplatte in 96-Well -Plattenlesegerät . Erstellen Sie eine neue Experiment -Seite und öffnen Sie das Menü Einstellungen . Geben Sie das richtige Absorption ( Anregung) und Emissionswellenlängen , wählen Sie dann die entsprechenden Wells gelesen werden soll.

Bei Durchführung einer Kinetik Experiment , stellen Sie die Zeit - Verlauf des Experiments und der Messintervallzeit(z. B. einmal pro 10 Minuten).

Beginnen Leseprobe .

Daten Analysieren mit Grafikfunktion von Microsoft Excel (oder eine andere Grafikprogramm wie GraphPad ) .