Western-Blot- Anweisungen

Western Blot-Analyse ist eine allgemein bekannte Technik für die Identifizierung spezifischer Proteine ​​aus Gewebe isoliert . Die verschiedenen Proteine ​​werden zunächst durch Ladung und Gewicht auf SDS- Polyacrylamid -Gel aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Nach der Übertragung markierten Antikörper binden spezifisch mit dem gewünschten Protein und mit einem Röntgenfilm oder durch Protein - spezifischen Farbstoffs sichtbar fotografiert. Das Endergebnis zeigt dunkle Bänder , die das Vorhandensein des identifizierten Proteins. Dieser Artikel konzentriert sich auf die grundlegende Methodik für die Durchführung Western-Blot- Analyse in einem Labor für komplexe Proteinforschung qualifiziert. Was Sie
SDS -Polyacrylamid-Gel (SDS -PAGE) mit getrennten Proteine ​​
Nitrocellulose -Membran
destilliertes wasser und Übergabepuffer (30 g Tris, 144 g Glycin und 200 ml Methanol in 1 l Brauchen Wasser)
Filterpapier , Whatman 3 mm
Labor Schwamm
Western-Blot- Transferkammer
Laborstromversorgung
Labor Kühlschrank
Labor Rührwerk
Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS ) ( 24,2 g Tris-Base , 80 g NaCl in 1 l Wasser)
Blockierungslösung (5 Prozent fettfreie Milchpulver in TBS )
Primärantikörperlösung
markierten Antikörper-Konjugat -Lösung
Alkaline Phosphatase-Substratlösung mit Nitroblau Tetrazolium Fleck
Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS )
Gel - Imager Box
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Proteine ​​auf Nitrozellulosemembran übertragen

1 Bereiten Sie die Nitrozellulosemembran . Die Membran sollte in destilliertem Wasser für zwei Minuten, dann in den Transferpuffer gegeben und für fünf Minuten einweichen eingeweicht werden.
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Bauen Sie ein Transfer -Sandwich , bestehend aus Schwamm /Filterpapier /SDS- PAGE /Nitrocellulose-Membran /Filterpapier /Schwamm. Das Sandwich wird so ausgerichtet, die Membran näher an der Anode und das Gel näher an der Kathode innerhalb der Transferkammer .
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In Transfer-Puffer in die Kammer , so dass die Sandwich eingetaucht . Setzen Sie die Kammer innerhalb des Labor-Kühlschrank . Transfer -Protein aus dem Gel auf die Membran sollte bei 4 Grad Celsius durchgeführt werden.
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bis die Stromversorgung , um Proteine ​​aus dem Gel auf die Membran übertragen Set . Die Richtung der Übertragung zu dem durch die rote Leitung angegeben Anode. Größere Proteine ​​bewegen sich schnell in Reaktion auf einen elektrischen Strom und wird zunächst zu bewegen. Die Stromversorgung steuert die Übertragungsrate . Stellen Sie die Leistung auf 30 V und 40 mA für einen Nachttransfer .
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Demontieren Sie die Stromversorgung nach dem Transfer abgeschlossen ist. Sie Kontakt mit dem Transferpuffer machen oder entfernen Sie das Sandwich während die Stromversorgung angeschlossen ist.
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Entfernen Sie die Membran von der Sandwich- und Inkubation für zwei Stunden in Blocking-Lösung . Proteine, die in der Blockierungslösung wird in die Membran , wo keine vorhanden sind Proteine ​​absorbieren. Es wird keinerlei Antikörper aus der Bindung an die Membran , wo das gewünschte Protein nicht vorhanden zu verhindern.
Bindung des Antikörpers
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mit primären Antikörperlösung inkubieren Nitrocellulosemembran mit einer Rührwerk . Die Membran ist vollständig in die Lösung für mindestens eine Stunde eingetaucht werden. Es ist akzeptabel, über Nacht inkubiert.
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Waschen Sie die Membran gründlich , um nicht gebundene Antikörper zu entfernen. Vier separate 10-minütigen Waschschritten mit TBS sind in der Regel ausreichend , um überschüssige Antikörper zu entfernen.
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Inkubation der Membran in markierten Antikörper -Konjugat-Lösung mit dem Rührwerk . Die Membran muss für mindestens eine Stunde inkubiert werden. Der markierte Antikörper -Konjugat mit alkalischer Phosphatase gebunden. Es ist die Enzym-Antikörper- Mischung, die zu erkennen und an den ersten Antikörper bindet.
Nachweis der Protein
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die Membran für 10 Minuten in PBS viermal Spülen . Dies wird den Rest des markierten Antikörper-Konjugat zu entfernen.
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Inkubation der Membran in der alkalischen Phosphatase -Substratlösung , bis Bandmuster angezeigt. Der Farbstoff in der Substratlösung wird mit dem Antikörper - Antigen - Protein in der Membran binden und eine dunkel gefärbte Bande bilden. Der Prozess kann sofort oder benötigen bis zu 30 Minuten , bevor die Bands eingehalten werden.
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Wickeln Sie die Membran vollständig in Zellophan und legen Sie sie direkt auf dem Gel - Imager , um die Ergebnisse zu visualisieren. Das Gel - Imager ist in der Lage zu fotografieren , die auf der Western-Blot- Membran angezeigten Ergebnisse .