Wie man eine Drei -Fragment -Ligation Problembehandlung

Ligation ist eine Methode in der biologischen Forschung zum Verbinden getrennte Stränge der DNA eingesetzt. Der Prozess wurde mit kommerziell erhältlichen Ligation Kits vereinfacht. Ein Ligationsverfahrenwird in der Regel durch Transformation, einem Prozess verbunden Einsetzen der DNA in einen bakteriellen Vektor Empfänger gefolgt , zu klonen und verstärken die DNA. Aufgrund der Komplexität des Verfahrens , die Ergebnisse oft nicht mit dem gewünschten Produkt entsprechen und erfordern Fehlerbehebung. Dies ist überwiegend in einem Versuch, mehrere Fragmente , wie in Dreifach- Ligation kommen . Was Sie brauchen
Ligation Kit
Ligation Protokoll
Agarose-Gel
50 X TBA Puffer ( 242 g Tris-Base , 57,1 ml Eisessig, 100 ml 0,5 M EDTA auf 1 Liter mit Wasser verdünnt )
VE- Wasser
DNA Purification Kit
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Problembehandlung Transformation
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Formulieren Sie eine Liste der Schritte, in Ligation und Transformation beteiligt. Fehlerbehebung keine wissenschaftliche Protokoll beginnt in der Regel mit dem letzten Schritt rückwärts funktioniert.
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Vergleichen gereinigten DNA-Produkt aus der Probe zu der Kontroll-DNA , die mit dem Kit zur Verfügung gestellt. Sobald DNA wurde in Bakterien transformiert und kloniert , kann es isoliert, gereinigt und durch Agarose- Gelelektrophorese überprüft . Die Ergebnisse für die Elektrophorese würde anzeigen, ob Transformation erfolgreich war.
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Bestimmen Bakterienwachstum während der Klonierung . Die meisten bakteriellen Vektoren sind so konstruiert, nur die mit einem DNA-Insert - wird auf einem Medium Ampicillin oder andere Antibiotika enthalten wachsen. Schlechtes Wachstum konnte feststellen, dass die DNA-Probe nicht erfolgreich in den Vektor eingefügt .
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bestätigen , dass die ligierten DNA-Probe wurde gereinigt , vor der Transformation . Puffersalze, Enzyme und Ligation konnte Umwandlung der eingefügten DNA hemmen. Es ist auch wichtig festzustellen, dass die Ligation Enzym wurde durch Hitze inaktiviert , nach Beendigung der Ligationsverfahren. Aktiv -Ligase könnte möglicherweise mit Transformation stören.
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Prüfen Sie das Datum auf die bakterielle Lager für die Transformation verwendet . Alte Bakterienzellen verlieren Effizienz über die Zeit. Schließlich die Bakterienzellen unfähig Transformation und Klonierung Qualität . Sobald der Prozess der Transformation diagnostiziert wurde , können Sie die Analyse der Ligationsverfahrenbeginnen.
Fehlerbehebung Ligation
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Bestätigen Sie die Reinheit Ihrer DNA-Probe , vor der Ligation . Salz- Verunreinigungen in der DNA-Probe konnte in armen Ligation führen. Die DNA-Probe sollte gereinigt und frei von Salzen und Enzymen zu sein, bevor es in die Ligation verwendet wird.
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Überprüfen Sie, ob die Enden der DNA-Stränge ligiert werden stumpf oder klebrig. Die Ligation wird verwendet, um getrennte Stränge mit stumpfen Enden oder klebrigen Enden zu verknüpfen, nach der Verdauung mit Restriktionsenzymen bezeichnet . T4 -DNA-Ligase ist das Enzym der Wahl für DNA stumpfen Ende - aber es wird auch für die DNA- arbeiten mit klebrigen Enden . Andere DNA-Ligasen kann nur für DNA arbeiten , nach einem Restriktionsverdau klebrige Enden zu erzeugen . Es ist wichtig, die richtige Ligase für die getestete DNA zu verwenden.
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Konzentration von DNA-Proben vor der Ligation Check. Mit DNA mit hoher Konzentration führt oft zu linearen DNA zu werden. Die Kit- Anweisungen werden Informationen über die richtige Menge an DNA bereitzustellen, um in einer Ligationsreaktion zu verwenden.
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Ersetzen Ligase -Enzym mit einem neuen Grundstück. Enzyme sind bei Raumtemperatur und setzte Frost-Tau- Zyklen besonders empfindlich . Die Ligase konnte nach einer Reihe von Anwendungen, einfach durch Einfrieren und Auftauen zu oft beschädigt werden. Einige Kits empfehlen, dass Ligase bei der ersten Verwendung in kleinere Portionen aliquotiert werden , um die Anzahl der Zeiten ist es wieder eingefroren ist, zu reduzieren.
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die Ligation Kit prüfen . Oft ist das Problem mit Ligation unter Verwendung eines Kits , die abgelaufen ist oder mit anderen DNA und Salze verunreinigt worden .