Fehlerbehebung für die Gelelektrophorese

Polyacrylamidgelelektrophorese oder PAGE ist eine Technik, die üblicherweise zur Trennung von organischen Molekülen in einer biologischen Probe verwendet. Moleküle mit geringer Größe und Gewicht schneller wandern auf einem Polyacrylamid- Gel , wenn ein elektrischer Strom angelegt wird. Klar getrennte Banden sind in der Regel beobachtet, nachdem der fertig Gel wird in einer speziellen Färbung inkubiert. Es ist ein relativ einfaches Verfahren . Jedoch könnte Abwesenheit von Banden oder Bänder , die verschmieren oder unrein ein Problem in einem oder mehreren Schritten des Verfahrens zeigen . Sie sollten grundlegende Richtlinien folgen, um eine Gel-Elektrophorese -Methode beheben, wenn Sie Ihre Ergebnisse nicht wie erwartet. Was Sie
Güteklasse bis benötigen: Acrylamid oder Fertigteilplatten
Zwei Glasplatten
Acrylamid : Bis
TBE -Puffer ( TRIS , Borsäure , EDTA )
Stromversorgung
Ober Pufferkammer Nieder
Pufferkammer
von Protein -DNA-Probe
TEMED
Ammoniumpersulfat
Gel Fleck
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mit starten der letzte Schritt der Gelelektrophorese erste und arbeiten nach hinten. Für die Gelelektrophorese , ist der letzte Schritt, das zur Probenbanden zu beobachten Färbeverfahren . Wenige Probleme sollte eigentlich während der Färbung auf. Allerdings sollten pulverförmige Farben gut in dem geeigneten Puffer gelöst werden, bevor sie verwendet werden , um ein Gel zu färben. Ermitteln Sie die richtige Konzentration von Flecken verwendet wurde.
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Überprüfen Sie die Stromversorgung . Die Abwesenheit von Banden konnten zeigen die Strom-oder Spannungseinstellungzu hoch war , und die Testprobenaus dem Gel migriert . Hohe Einstellungen können auch dazu führen, Probenbestandteile durch das Gel zu schnell zu migrieren, was eine schlechte Auflösung und Bands, die unrein erscheinen . Die Proben können nicht durch das Gel wandern , wenn die Versorgungseinstellung ist gering. Proben können auch aus dem Brunnen, wo sie geladen wurden treiben und nicht wandern durch das Gel.
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Überprüfen Sie die Flüssigkeit , um den Acrylamid- Polyacrylamid-Gel- Druckguss verwendet . Typischerweise ist der Anteil von Acrylamid verwendet, um ein Polyacrylamid -Gel im Bereich von 5 bis 15 Prozent gegossen. Proben von größeren Molekülen enthalten sind, auf einer 5- Prozent -Gel geladen , weil große Fragmente bewegen sich langsamer auf Gelen mit einem höheren Prozentsatz Acrylamid . Kleine Moleküle werden auf einer höheren Prozent -Gel geladen , weil eine geringe Konzentration Gel wäre nicht in der Lage, kleinere Proben der Lösung sein .
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Überprüfen Sie die verwendet werden, um die Acrylamid polymerisieren Reagenzien . Ein Polyacrylamid- Gel durch Polymerisation einer flüssigen Mischung , bestehend aus Acrylamid und Bisacrylamid ist. Ammoniumpersulfat und TEMED werden dem Acrylamid zugegeben , um die Gelbildung zu katalysieren. Typischerweise sollte die Acrylamid Anzeichen von Polymerisation ( Gelbildung ) zeigen 15 Minuten nach Ammoniumpersulfat und TEMED wurden hinzugefügt. Polymerisation , die zu schnell auftritt, ist das Ergebnis von hohen Mengen Ammoniumpersulfat . Zu wenig Ammoniumpersulfat kann dazu führen, unvollständige oder unebenen Polymerisation .
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Bestätigen Sie die Menge der Proben geladen. Hohe Konzentrationen der Proben kann träge durch das Gel bewegen und reduzieren Bandauflösung. Eine Probe , die Konzentration niedrig ist, kann nicht beobachtet, nachdem das Gel wurde gefärbt werden. Diese Flecken haben Beschränkungen hinsichtlich der Mindestprobenmenge, die als Folge von Flecken Empfindlichkeit abgebildet werden kann .
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Qualität der Proben geladen bestätigen . Salze und andere Verunreinigungen in einer Probe vorhanden ist, kann die Bewegung der Probe entlang des Gels beeinflussen. Elektrophorese ist das Ergebnis von elektrischem Strom durch ein Gel , das eine stromleitende Laufpuffer enthält ; hohe Salzkonzentrationen in der Probe kann die Bewegung dieser Strom durch das Gel beeinflussen. Ihre Isolierung einer Probe sollte eine Reinigungs-Kits , die eine relativ reine Probe produzieren zu integrieren.
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Bewertung der Literatur oder das schriftliche Protokoll, um festzustellen, ob die richtige PAGE wurde verwendet, um das Experiment durchzuführen . Der Prozentsatz an Acrylamid in PAGE ist spezifisch für die Größe des zu testenden Probe . Die Literatur könnte auch spezifische Informationen in Bezug auf die Stromversorgung und die Geschwindigkeit der Migration auf Probe eingestellt .