Mit welchen Methoden lassen sich Protein-Protein-Wechselwirkungen untersuchen?

Zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen können verschiedene Methoden eingesetzt werden. Hier sind einige häufig verwendete Techniken:

1. Co-Immunpräzipitation (Co-IP) :Co-IP ist eine weit verbreitete Technik zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Dabei handelt es sich um die Immunpräzipitation eines Proteins (Köderproteins) aus einem Zelllysat unter Verwendung eines für das Köderprotein spezifischen Antikörpers. Der immunpräzipitierte Proteinkomplex wird dann analysiert, um andere Proteine ​​(Beuteproteine) zu identifizieren, die mit dem Köderprotein interagieren. Auf Co-IP können verschiedene nachgelagerte Analysemethoden folgen, wie zum Beispiel Western Blot, Massenspektrometrie oder Immunfluoreszenzfärbung.

2. Pull-Down-Assays :Pull-Down-Assays basieren auf dem Prinzip der Affinitätschromatographie. Ein Köderprotein wird durch kovalente Bindung oder Fusion mit einem Tag (z. B. GST oder His-Tag) auf einem festen Träger (z. B. Magnetkügelchen oder Agaroseharz) immobilisiert. Das Zelllysat oder die gereinigte Proteinmischung wird dann mit dem immobilisierten Köderprotein inkubiert. Nach dem Waschen zur Entfernung ungebundener Proteine ​​werden die interagierenden Proteine ​​(Beuteproteine) eluiert und analysiert.

3. Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) :FRET ist eine Technik, die den Energietransfer zwischen zwei eng beieinander liegenden Fluorophoren (Donor und Akzeptor) misst. Wenn sich die Donor- und Akzeptor-Fluorophore in unmittelbarer Nähe befinden (typischerweise innerhalb von 10–100 Å), führt die Anregung des Donor-Fluorophors zur Emission von Licht durch das Akzeptor-Fluorophor. Dieser Energietransfer kann quantifiziert und zur Überwachung von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet werden. FRET kann auf verschiedene Weise implementiert werden, einschließlich der Markierung von Proteinen mit spezifischen Fluorophoren oder der Verwendung genetisch kodierter fluoreszierender Proteine ​​(z. B. GFP und RFP).

4. Biomolekulare Interaktionsanalyse (BIA) :BIA, auch bekannt als Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), ist eine markierungsfreie Technik, die Änderungen im Brechungsindex an der Grenzfläche eines Glasobjektträgers und einer fließenden Flüssigkeit misst. Eines der interagierenden Proteine ​​wird auf der Glasoberfläche immobilisiert und das andere Protein wird über die Oberfläche geleitet. Durch die Wechselwirkung zwischen den Proteinen kommt es zu Veränderungen des Brechungsindex, die nachgewiesen und quantifiziert werden können. BIA kann Informationen über die Bindungsaffinität und Kinetik von Protein-Protein-Wechselwirkungen liefern.

5. Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) :ITC ist eine Technik, die die Wärmeänderung misst, die mit der Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen einhergeht. Wenn Proteine ​​interagieren, wird Wärme entweder freigesetzt (exotherm) oder absorbiert (endotherm). ITC kann die Bindungsaffinität (Kd) und thermodynamische Parameter wie Enthalpieänderung (ΔH) und Entropieänderung (ΔS) von Protein-Protein-Wechselwirkungen quantifizieren.

6. Protein-Interaktions-Arrays :Protein-Interaktionsarrays umfassen das Hochdurchsatz-Screening von Protein-Protein-Wechselwirkungen in einem Microarray-Format. Tausende verschiedener Proteine ​​oder Peptide werden auf einer festen Oberfläche immobilisiert und die Bindung eines bestimmten Proteins von Interesse wird mithilfe markierter Antikörper oder anderer Nachweismethoden nachgewiesen. Diese Technik ermöglicht eine schnelle und groß angelegte Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen.

7. Yeast Two-Hybrid (Y2H)-Assay :Der Y2H-Assay ist eine genetische Methode zur Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen in Hefezellen. Dabei werden die kodierenden Sequenzen zweier Proteine ​​mit zwei verschiedenen Domänen eines Transkriptionsfaktors fusioniert. Wenn die beiden Proteine ​​interagieren, wird der Transkriptionsfaktor wiederhergestellt, was zur Expression eines Reportergens führt. Positive Wechselwirkungen werden anhand des Wachstums von Hefezellen auf selektiven Medien oder kolorimetrischen Tests identifiziert.

Die Wahl der Methode zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen hängt von den spezifischen interessierenden Proteinen, der Verfügbarkeit von Reagenzien und Geräten sowie dem gewünschten Informationsniveau ab. Auch Kombinationen dieser Techniken können eingesetzt werden, um umfassende Einblicke in Protein-Protein-Interaktionen zu erhalten.