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Kryokonservierung Verfahren sind diejenigen, die Zellen zu erlauben, auf unbestimmte Zeit durch die Verwendung extrem kalten Temperaturen, um Stoffwechselaktivitäten aussetzen gespeichert werden. Es gibt zwei Haupttypen von Kryokonservierung Verfahren: Gleichgewicht ( herkömmlichen langsamen Einfrieren ) und Nicht- Gleichgewichts-oder ultra- schnelles Einfrieren ( Vitrifikation ) . Der Begriff der Verglasung kommt vom lateinischen " glasigen " oder glasig. Beide Verfahren nutzen Gefrierschutzmittel mit Frostschutzmittel -Typ- Eigenschaften , um Zellschäden während des Gefrierprozesses zu verhindern. Sobald Zellen werden eingefroren oder vitrifiziert , kann sie auf unbestimmte Zeit in flüssigem Stickstoff durch eine extrem kalte Fluid mit einer Temperatur von -196 C ( -321 F) eingetaucht werden gespeichert. Um die Stoffwechselaktivität in der Zelle beim Auftauen wiederherzustellen, müssen toxische Kälteschutzmittel aus der Zelle und dem normalen Wasserhaushalt allmählich wiederhergestellt, wie die Zelle zu einem normalen Funktionieren Temperatur zurück entfernt werden.
Zell spezifische Faktoren
verwendet, um Zellen oder Gewebe kryokonserviert Verfahren hängt von einer Reihe von Faktoren, einschließlich der Größe der Zelle , die Anzahl der Zellflüssigkeit ( Zytoplasma ) und der Komplexität der Zelle ( Einzelzellen- oder Gewebe) . Zellen, die mit einer großen Menge an Zytoplasma , wie Eier sind schwieriger Kryokonservierung als Zellen, die nur Rest Zytoplasma , wie Spermien . Kryokonservierung von Ovarialgewebe ist schwieriger , da zumindest drei unterschiedlichen Zelltypen in unterschiedlichen Größen in Eierstockgewebe , die jeweils mit unterschiedlichen Bedürfnissen optimal Einfrieren vorhanden sind. Langsames Einfrieren Protokolle mit Erfolg verschiedene Arten von Zellen verwendet worden. Die Verglasung ist derzeit die effektivste mit Einzelzell Einfrieren und weniger effektiv mit Gewebe , aber die Forschung ist im Gange, um die Verglasung von Geweben zu optimieren.
Rolle der Gefrierschutz
Das Zytoplasma eine Zelle enthält Wasser, das zu Eis Kristalle bei Gefriertemperatur schaltet . Bei Eisbildung innerhalb einer Zelle wird die Zelle zerkleinert und stirbt. Daher wird die Flüssigkeit in der Zelle muss vor Erreichen Gefriertemperaturen zu Zellschäden zu vermeiden entfernt werden. Verschiedene Arten von Frostschutzmittel ( Gefrierschutzmittel ) Flüssigkeiten verwendet , um die Zelle vor dem Einfrieren , einschließlich Glycerin, Propandiol , Dimethylsulfoxid sulfoxde (DMSO) , Ethanol und Zucker wie Saccharose und Trehalose zu dehydratisieren . Die optimale Geschwindigkeit der Abkühlung ( und Auftauen) hängt von der Art des verwendeten Gefrierschutzmittel und auf der Kennlinie der Zelle oder des Gewebes ist ( oder war ) eingefroren. Gefrierschutzmittel sind giftig für Zellen, so Metabolisierung Zelle Forderungen an Gefrierschutzmittel bei wärmeren Temperaturen Stoffwechsel muss minimiert oder vermieden werden. Nach dem Auftauen oder Erwärmen der Zellen muss Gefrierschutzmittel vollständig von der Zelle entfernt werden, bevor die Stoffwechselaktivität wieder hergestellt ist.
Equilibrium Versus Non- Equilibrium Kryokonservierung Ordnung
Die Geschwindigkeit des Einfrierens abhängig davon, ob die GefrierprotokollGleichgewichts - oder Nicht- Gleichgewichts- Basis . GleichgewichtstypVerfahren wird die optimale Gefrierrate erreicht, wenn es ein Gleichgewicht zwischen der Rate, mit der die Zelle wird Wasser dehydratisiert und die Rate , mit der Wasser aus der Zelle wurde in dem Eis -Bühne . Diese Gleichgewichts oder langsam gefrier Protokolle nehmen normalerweise Stunden in Anspruch und ein Computer verwendet wird , um eine programmierbare Gefrierratelaufen, um sicherzustellen, dass die Gefrierratensind genau nach Bedarf. Es ist typischerweise ein " hold" Schritt in das Protokoll in der Nähe der Start in die manuelle Erstellung von Starter- Eiskristalle oder " Seeding " ermöglichen in der Flüssigkeit außerhalb der Zellen .
Verglasung , ein ganz anderer Ansatz , um ein Einfrieren , die nicht auf Rampen angewiesen ist und die Erreichung eines Gleichgewichts zwischen Dehydrierung und die Bildung von Eiskristallen verwendet. Verglasung ist so extrem schnell, dass es nicht genügend Zeit für die Bildung von Eis und die Zellflüssigkeit wird direkt in einen glasartigen oder Glasphase überführt wird , ohne Schädigung der Zelle . Programmierbare Rate Gefriergeräte sind nicht erforderlich, da die Zelle direkt stürzte sich in extrem kalten flüssigen Stickstoff und erreicht eine sofortige glasartigen Zustand .
Langsam - Freeze- Verfahren
Der erste Schritt der langsame Gefrierverfahrensist es, die Zelle zu Gefrierschutzmittel in einer allmählichen stufenweise aussetzen langsam ermöglichen Gleichgewicht der Zelle mit dem Gefrierschutzmittel beim Freiwasser . Sobald die Zellen der meisten zellulären Wasser gelöscht wurde, werden die Zellen in der Kälteschutzmittelflüssigkeit in einem Behälter von einer Art angeordnet ist, wie beispielsweise ein Kunststoff-Strohhalm , eine Glasampulle oder einem Kunststoff vial.The Flüssigkeitsvolumen umgebenden Zellen langsamen Einfrieren ist typischerweise kleiner als ein Teelöffel und nur ein paar Tropfen sein . Der etikettierte Behälter wird gefüllt , versiegelt und in ein programmierbares Gefrier , die langsam abnimmt, die Temperatur des Behälters über einen Zeitraum von Minuten oder Stunden auf sehr niedrige Temperaturen gebracht . Nach ein paar Minuten der Abkühlung, müssen Starter Eiskristallen innerhalb des Behälters durch " Säen " gebildet werden der Behälter . Impfen mit einem Werkzeug (beispielsweise einer Pinzette ) in flüssigem Stickstoff wurde die vorgekühlte haben , um den Behälter zu berühren und die Bildung von Eiskristallen verursachen geführt . Dieses Starter Kristall kontrollierte Bildung von Eiskristallen in einem Punkt sicher weg von den Zellen zu initiieren . Sobald Aussaat abgeschlossen ist, kann der Rest der Kühlrampengehen . Wenn der Behälter Temperaturen zwischen -30 und -85 C erreicht, kann der Behälter, der die Zellen direkt in flüssigen Stickstoff getaucht zu vervollständigen die Abkühlung auf -196 C
Vitrification
werden
ultra-schnelle nicht-Gleichgewichts Chillen Verfahren wie die Verglasung verwenden höhere Konzentrationen von Gefrierschutzmittel in Verbindung mit einer fast sofortigen Einfrieren Rate durch Eintauchen Zellen direkt in flüssigen Stickstoff erreicht . Verglasungs umgeht das Eis - Kristallbildung Phase und bewegt sich das Wasser direkt in einen glasartigen Phase . Verglasung erzielt den gleichen Endpunkt wie langsamen Einfrieren , aber mit einer Rate von -3000C/min Vergleich zu 10C/min oder mehr. Für die Vitrifikation werden die Zellen in der Regel auf der Spitze eines Stroh und überschüssiges Kälteschutzmittel entfernt angeordnet ist, so dass gerade genug, so dass die Zelle hängt an dem Behälter durch Oberflächenspannung vor dem Eintauchen in flüssigen Stickstoff. Weil Einfrieren ist so schnell , ist die Dauer der Einwirkung Kryoschutzmitteln viel weniger und viel höhere Konzentrationen an Kälteschutzmittel können von der Zelle toleriert werden. Die Erwärmung der Zelle, um sie in den normalen Stoffwechselfunktion zurückgeben, müssen auch unglaublich schnell. Handhabung von Steinprobenist viel anspruchsvoller als langsam eingefrorenen Proben , weil auch eine kurze Exposition auf eine Temperatur über der von flüssigem Stickstoff einen ungeplanten Erwärmungsprozess und Wiedereinfrieren , die schädlich für die Zelle zu starten.
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