Molecular Cloning Protocols

Molecular cloning Protokolle umfassen die für die Festlegung , die Isolierung und die Replikation einer DNA-Sequenz verwendet Verfahren. Traditionelle Restriktion und Ligation Klonen Protokolle initiieren DNA-Fragmentierung mit eingeschränkter Endonukleasen ( Enzyme, die DNA-Stränge geschnitten an Restriktionsstellen ), DNA -Fragment -Ligation (die Reparatur von Diskontinuitäten in DNA-Moleküle ) , Transfektion ( die Einführung der Nukleinsäure in einem Zellkörper ) und die Auswahl (die Wahl der einzelnen Genome für die Replikation ) . Isolation

Protokolle für die Isolierung eines DNA-Fragments , der erste Schritt in der molekularen Klonierung, enthalten häufig eine Polymerase-Kettenreaktion (PMR ), das Zyklen von Erhitzen und Abkühlen verwendet , um Stücke von DNA zu amplifizieren. Um das Ziel zu erreichen Sequenzgröße , auch andere Protokolle DNA- Beschallung, Reaktions Enzym die Verdauung und die Verwendung von chemisch synthetisierten Oligonukleotiden . Diese Protokolle variieren abhängig von der Größe und der Menge der isolierten DNA benötigt .
Ligation

Protokolle für die Ligation beinhalten die Verwendung eines Enzyms DNA-Ligase DNA-Moleküle zusammen mit beitreten eine kovalente Bindung . Protokoll diktiert, die Kombination von DNA-Fragmenten , die Klonierungsvektor , ein Ligationspuffer , der die DNA -Ligase und sterilisiertes Wasser in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Inkubation über Nacht bei 4 Grad Celsius.
Transfektion
< br >

Protokolle für die Transfektion oder die Infusion von DNA in eine Zelle unter Verwendung eines nicht-viralen Mitteln , oft mit DNA- Injektion direkt in das Cytoplasma der Zelle . Andere Verfahren umfassen die Verwendung von chemischen Reagenzien , wie z. B. Calciumphosphat und Lipiden, die Transfektion Komplex durch die Zellmembran zu liefern. Dieses Verfahren prüft die Auswirkungen der genetischen Veränderung auf die Funktion bestimmter Gene .
Auswahl

Auswahl oder Screening -Protokolle bestimmen, welche Zellen erfolgreich die DNA-Insert und zeigen die Zellen brauchen Isolation. Eine Zentrifuge Ernten Zellen, die die transfizierte DNA , die dann in einem Lysozym inkubiert ( ein natürlich vorkommendes Enzym) enthalten, Puffer und mit einem alkalischen Waschmittel behandelt, wobei die Proteine ​​und Membranen Löslichkeit . Mit Acetat , um die Proteine ​​zu fällen , eine Zentrifuge und Mulltuch filtern die DNA-haltige Überstand (der aus einer Verbindung zentrifugiert verbleibende lösliche Flüssigkeit) . Der Überstand mit Polyethylenglykol gefällt , zentrifugiert und in einer Cäsiumchlorid- Ethidiumbromid -Puffer suspendiert. Das Ethidiumbromid färbt die DNA nach Dichte und mit einer langwelligen UV-Licht wird die untere DNA Bande mit einem Fünf -cc-Spritze entnommen . Eine äquilibrierte Ionenaustauschsäule trennt die DNA aus der Ethidiumbromid -und Cäsiumchlorid , und das endgültige DNA -Pellet wird in einer Pufferlösung suspendiert und auf Agarose- Gelelektrophorese nachgewiesen .